携带低氧诱导因子1α慢病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞后成骨基因的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.28.005

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (28): 4455-4462.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.28.005

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携带低氧诱导因子1α慢病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞后成骨基因的表达

付志杰^1，2，张巨峰^1，2，3，王大平^1，2，3，陈洁琳^1，2，3，段莉^1，2，3，何美建^1，2，李庆庆^1，2，李文翠^1，2，熊建义^1，2，3

¹汕头大学医学院深圳二院临床学院，广东省深圳市 518035；²深圳市第二人民医院骨科，广东省深圳市 518035；³深圳市组织工程重点实验室，广东省深圳市 518035

出版日期:2014-07-02 发布日期:2014-07-02
通讯作者: 熊建义，教授，主任医师，硕士生导师，深圳市第二人民医院骨科，广东省深圳市 518035
作者简介:付志杰，男，1988年生，湖北省孝感市人，汉族，在读硕士，主要从事创伤骨科、骨组织工程研究。
基金资助:
广东省自然科学基金(S2012010008129)；深圳市战略性新兴产业发展专项资金(20120614154551201)；深圳市科创委国际合作项目(GJHZ20130412153906740)；深圳市科创委技术开发项目(CXZZ20120614160234842)

Expression of osteogenic genes in rat bone marrow mesenchymal stem cells infected by lentivirus carrying hypoxia-inducible factor-1 alpha

Fu Zhi-jie ^{1, 2}, Zhang Ju-feng ^{1, 2, 3}, Wang Da-ping ^{1, 2, 3}, Chen Jie-lin ^{1, 2, 3}, Duan Li ^{1, 2, 3}, He Mei-jian ^{1, 2}, Li Qing-qing ^{1, 2}, Li Wen-cui ^{1, 2}, Xiong Jian-yi ^{1, 2, 3}

¹ Shenzhen Second Hospital Clinical School of Shantou University Medical College, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China; ²Department of Orthopedics, Shenzhen Second People’s Hospital, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China; ³Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China

Online:2014-07-02 Published:2014-07-02
Contact: Xiong Jian-yi, Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Shenzhen Second Hospital Clinical School of Shantou University Medical College, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China; Department of Orthopedics, Shenzhen Second People’s Hospital, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China; Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China
About author:Fu Zhi-jie, Studying for master’s degree, Shenzhen Second Hospital Clinical School of Shantou University Medical College, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China; Department of Orthopedics, Shenzhen Second People’s Hospital, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. S2012010008129; the Special Funds for the Development of Strategic Emerging Industries of Shenzhen City, No. 20120614154551201; the International Cooperation Project of Commission on Science and Technology Innovation of Shenzhen City, No. GJHZ20130412153906740; the Technology Development Project of Commission on Science and Technology Innovation of Shenzhen city, No. CXZZ20120614160234842

摘要/Abstract

摘要：

背景：人低氧诱导因子1α可调控其下游成骨及成血管基因的表达，具有提高成骨活性的作用。
目的：观察携带人低氧诱导因子1α慢病毒感染的大鼠骨髓间充质干细胞中成骨基因表达情况。
方法：通过RT-PCR方法从Hela细胞中获得低氧诱导因子1α，构建携带低氧诱导因子1α的慢病毒表达质粒Lenti-HIF-1α-eGFP，与LentiPac HIV混合包装质粒共包装293Ta细胞，获得病毒；采用全骨髓直接贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，使用流式细胞仪对骨髓间充质干细胞进行鉴定。分别在慢病毒感染骨髓间充质干细胞1，4，7，14 d后，用实时荧光定量PCR检测骨髓间充质干细胞中成骨基因骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶的表达水平。
结果与结论：Lenti-HIF-1α-eGFP有效地感染骨髓间充质干细胞，实时荧光定量PCR检测结果显示成骨基因骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶在Lenti-HIF-1α-eGFP感染后第4天开始明显过表达，且持续至14 d。结果表明低氧诱导因子1α可以提高骨髓间充质干细胞的成骨活性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 低氧诱导因子1α, 骨髓间充质干细胞, 基因转染, 骨缺损, 慢病毒载体, 骨组织工程, 成骨基因, 成骨活性, 广东省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Human hypoxia-inducible factor-1 alpha can regulate the expression of osteogenic and angiogenic genes, and promote osteogenic activity.
OBJECTIVE: To observe the expression of osteogenic genes in rat bone marrow mesenchymal stem cells carrying human hypoxia-inducible factor-1 alpha slow virus infection.
METHODS: Hypoxia-inducible factor-1 alpha was obtained from Hela cells using RT-PCR. Lentivirus expression vector plasmid carrying hypoxia-inducible factor-1 alpha (Lenti-HIF-1α-eGFP) was constructed. 293Ta cells with LentiPac HIV mixed packaging plasmid was packaged, and then lentivirus was obtained. Rat bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured using direct whole bone marrow adherent method. Bone marrow mesenchymal stem cells were identified using flow cytometry. Bone marrow mesenchymal stem cells were infected with slow virus for 1, 4, 7 and 14 days. Bone morphogenetic protein-2, osteocalcin, osteopontin and alkaline phosphatase expression levels were detected in bone marrow mesenchymal stem cells using real-time fluorescent quantitative PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cells were effectively infected with Lenti-HIF-1α-eGFP. Real-time fluorescent quantitative PCR results revealed that bone morphogenetic protein-2, osteocalcin, osteopontin and alkaline phosphatase began to obviously overexpress from 4 days after infection with Lenti-HIF-1α-eGFP until 14 days. Results suggested that hypoxia-inducible factor-1 alpha could elevate the osteogenic activity of bone marrow mesenchymal stem cells.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, hypoxia-inducible factor 1, alpha subunit, lentivirus, transfection

中图分类号:

R394.2

付志杰，张巨峰，王大平，陈洁琳，段莉，何美建，李庆庆，李文翠，熊建义. 携带低氧诱导因子1α慢病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞后成骨基因的表达[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(28): 4455-4462.

Fu Zhi-jie, Zhang Ju-feng, Wang Da-ping, Chen Jie-lin, Duan Li, He Mei-jian, Li Qing-qing, Li Wen-cui, Xiong Jian-yi. Expression of osteogenic genes in rat bone marrow mesenchymal stem cells infected by lentivirus carrying hypoxia-inducible factor-1 alpha [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(28): 4455-4462.

图/表（结果） 6

2.1 低氧诱导因子1α基因的获得提取HeLa细胞总RNA，通过RT-PCR方法扩增低氧诱导因子1α基因，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，大小在2 000-2 500 bp之间，与Genebank中低氧诱导因子1α基因阅读框长度2 208 bp相符(图1)。

2.2 成功构建了Lenti-eGFP-HIF-1α HIF-1αPCR产物和慢病毒载体Lenti-eGFP分别经BamHⅠ和PspXⅠ限制性内切酶酶切后，进行连接，连接产物转化大肠杆菌后，挑取菌落培养后，抽提质粒，用Acc65Ⅰ和Xho Ⅰ酶切的方法鉴定重组的阳性质粒。经过Acc65Ⅰ酶切后，切出2个片段，大小分别为6 984 bp，3 841 bp，经过Xho Ⅰ酶切后，切出3个片段，大小分别是8 639 bp，2 144 bp，42 bp，说明成功构建了Lenti-eGFP- HIF-1α(图2)。

2.3 成功包装了携带低氧诱导因子1α的慢病毒用构建的慢病毒表达载体Lenti-HIF-1α-eGFP与LentiPac HIV 混合包装质粒共转染293Ta细胞，包装出病毒后收集病毒原液，用浓缩的慢病毒感染293Ta细胞48 h后，根据孔稀释法计算出病毒滴度为5×10⁷ TU/mL。

2.4 SD大鼠骨髓间充质干细胞的鉴定

2.4.1 骨髓间充质干细胞的形态学观察骨髓细胞接种于培养皿后，镜下可见大量大小不一的圆形细胞悬浮于培养液中。培养24 h后开始有细胞贴壁生长，呈多边形、梭形。通过换液去除未贴壁细胞后，可见短梭形、星形细胞分散在培养皿贴壁生长。培养5 d后，细胞排列较整齐，融合成片生长，融合率达80-90%(图3A)。消化传代至第3代后，细胞形态基本一致，为长梭形，朝向同一方向排列，呈“鱼群”样(图3C)。

2.4.2 骨髓间充质干细胞表面标记物检测流式细胞仪检测结果显示，第3代大鼠骨髓间充质干细胞表面标记物CD90与CD105表达为阳性，阳性率分别为99.8%、97.3%(图4)。

2.5 慢病毒对大鼠骨髓间充质干细胞感染效率检测用MOI=50的病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞48 h后，倒置荧光显微镜下观察约80%细胞荧光表达呈阳性(图5)。

2.6 荧光定量RT-PCR检测各组各时相大鼠骨髓间充质干细胞中成骨因子表达水平荧光定量PCR检测骨髓间充质干细胞中骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶mRNA的表达水平，结果显示：与空载体组及空白对照组相比，实验组各成骨因子表达水平显著增高(P值分别为0.037，0.047，0.038，0.033，均小于0.05)。①实验组大鼠骨髓间充质干细胞中骨形态发生蛋白2的表达水平在转染后1，4，7，14 d分别为空载体组的2.96倍、6.85倍、6.48倍、6.17倍(图6A)。②实验组大鼠骨髓间充质干细胞中骨钙蛋白的表达水平在转染后1，4，7，14 d分别为空载体组的2.50倍、5.33倍、7.13倍、7.07倍(图6B)。③实验组大鼠骨髓间充质干细胞中骨桥蛋白的表达水平在转染后1，4，7，14 d分别为空载体组的2.44倍、4.98倍、6.27倍、7.32倍(图6C)。④实验组大鼠骨髓间充质干细胞中碱性磷酸酶的表达水平在转染后1，4，7，14 d分别为空载体组的2.27倍、4.43倍、5.81倍、5.38倍(图6D)。空载体组与空白对照组相比，各成骨因子表达水平差异无显著性意义(P > 0.05)。

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引言

因创伤、肿瘤、炎症等导致的大范围骨缺损是临床上长期面临的难题，严重危害人类健康。传统的治疗手段如自体骨移植存在骨量缺乏、同种异体骨移植有传播疾病可能、异种异体骨移植则会产生免疫排斥反应等问题，因此骨组织工程已成为治疗大范围骨缺损的新策略^[1]。目前在动物实验中，组织工程骨修复小范围骨缺损时，骨折的愈合效果很好，但是在修复大范围骨缺损时，中心部分经常发生缺血坏死。因此，单纯的使用组织工程骨治疗大范围骨缺损困难重重。近年的研究表明，将具有促成骨作用的基因(如骨形态发生蛋白2)通过基因转染的方法整合到种子细胞中，可以诱导其向成骨方向分化，提高成骨活性^[2]。骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中的一类具备多方向分化潜能的非造血干细胞，在一定的诱导条件下能向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等方向分化^[2-6]。而且骨髓间充质干细胞在临床上已被应用于治疗移植物抗宿主病和同种异体造血干细胞移植，其生物安全性已得到证实^[7]。然而骨髓间充质干细胞不易于外源基因导入，因此选择合适的基因转染技术至关重要。慢病毒载体是应用最广泛的转基因载体之一，具有下列优点：①可实现目的基因高效转染靶细胞并能长期稳定表达。②能将目的基因插入到靶细胞基因组DNA中构建稳定的转化细胞株从而实现长期表达。③慢病毒包装工艺相对简单。④慢病毒载体经改构后，不在宿主细胞繁殖，不易诱发免疫反应，不会导致宿主细胞死亡，被它感染的细胞能连续传代，生物安全性高^[8]。大量研究证实以慢病毒为基因转染载体，将外源基因导入骨髓间充质干细胞中是一种可靠有效的方法^[9-10]。

低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1alpha，HIF-1α)作为低氧反应的一种核转录调节因子，通过对其下游靶基因的诱导表达，调控血管生成、能量代谢、细胞增殖迁移分化等反应^[11-13]。最新的研究显示低氧诱导因子1α具有促进骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的作用^[14]。

本研究拟构建携带低氧诱导因子1α的慢病毒，将其感染大鼠骨髓间充质干细胞，检测成骨基因的表达水平，探讨低氧诱导因子1α是否提高骨髓间充质干细胞的成骨活性，为下一步应用低氧诱导因子1α修饰的骨髓间充质干细胞治疗骨缺损的动物实验研究奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：单一样本观察实验。

时间及地点：实验于2013年9月至2014年3月在深圳市第二人民医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：雄性SD大鼠，4周龄，体质量90-100 g，购自广东省动物实验中心。

质粒和细胞：Lenti-eGFP质粒与大肠杆菌感受态细胞DH-5α购自美国 GeneCopoeia公司；293Ta细胞、Hela细胞购自中科院上海科学研究所细胞库。

引物：实验过程中所需引物均为自行设计，由Invitrogen(广州)贸易有限公司合成。

实验方法：

真核表达载体Lenti-HIF-1α-eGFP的构建及鉴定：从Hela细胞中提取总RNA，反转录生成cDNA。设计引物，以cDNA为模板，设计PCR引物：根据GenBank中已公布的大鼠HIF-1α基因序列(GenBank：AF057308.1)设计引物，引物信息如下(下划线处分别为BamHⅠ和PspXⅠ酶切位点)：HIF-1α F(BamHⅠ)：act aga tgc ttt att gga tcc ggt acc ATG GAG GGC GCC GGC GGC GCG AA，HIF-1α R(PspXⅠ)：agc tgg gtt gcg gcc gca ctc gag CTA AAT AAT TCC TAC TGC TTG AAA AA。将扩增出的基因片段与慢病毒载体Lenti-eGFP用BamHⅠ和PspXⅠ分别进行酶切。凝胶电泳分离酶切产物，切胶回收目的片段。使用T₄ DNA ligase连接上述PCR产物与慢病毒载体Lenti-eGFP，取10 μL连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH-5α，涂布至含抗生素LB平板，37 ℃恒温培养箱过夜。第2天挑取单菌落进行PCR鉴定，挑选阳性克隆接种到10 mL含抗生素的LB液体培养基中，37 ℃摇床培养12-16 h，抽提质粒。分别用Acc65Ⅰ和XhoⅠ酶切后进行凝胶电泳鉴定。

慢病毒载体Lenti-HIF-1α-eGFP的构建：用构建的慢病毒表达载体Lenti-HIF-1α-eGFP、Lenti-eGFP及LentiPac HIV混合包装质粒共转染293Ta细胞，包装病毒，收集病毒原液，浓缩后测定滴度。

慢病毒的包装： ①取细胞状态良好，处于对数生长期的293Ta细胞，接种于6孔细胞培养板，37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度细胞培养箱中培养。②取慢病毒HIF-1α表达质粒、eGFP阳性对照质粒各1 μL，分别加入5.0 μL LentiPac HIV混合包装质粒，均以Opti-MEMI稀释至200 μL。③以Opti-MEMI稀释30 μL EndoFectin 转染试剂至 400 μL。室温培养20 min后，边轻柔进行涡旋，边往步骤②中2个EP管各加入稀释的EndoFectin 转染试剂200 μL。④将上述2管混合液体分别加入到6孔细胞培养板中，轻柔涡旋平板使复合物分散。放置在37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度细胞培养箱中继续培养。⑤12 h后，吸出旧培养基，加入含体积分数为5%胎牛血清、青霉素和链霉素的新鲜DMEM培养基，再往各孔中加入4 μL TiterBoost 试剂。在37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度细胞培养箱中继续培养。⑥转染48 h后收集培养基，以500 r/min离心10 min去除细胞碎片，获得含慢病毒颗粒的培养基。

采用PEG8000浓缩法对收集的病毒原液进行浓缩，用孔稀释法测定病毒滴度。

全骨髓贴壁培养法分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞： ①将大鼠脱颈处死，无菌条件下取出双侧股骨和胫骨。②从股骨干和胫骨干中间剪断，用5 mL无菌注射器抽取SD大鼠骨髓间充质干细胞完全培养液反复冲洗骨髓腔。将冲洗液反复吹打混匀，制成细胞悬液后转移至60 mm培养皿中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱内培养。③48 h后首次换液，以后每2 d换液1次。④五六天细胞生长融合达80%以上，以0.25%Trypsin-EDTA消化后按1∶3的比例传入25 cm²培养瓶中。用上述方法传代2次，获得第3代骨髓间充质干细胞备用。

流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志： ①取传自3代生长良好的骨髓间充质干细胞，培养至对数生长期后，用0.25%Trypsin-EDTA消化细胞，PBS洗涤细胞，1 000 r/min离心5 min，计数后调整细胞浓度为5×10⁹ L^-¹。②取细胞悬液100 μL，分别加入FITC-CD90及FITC-CD105抗体20 μL，避光室温孵育20 min，孵育完毕后PBS洗涤细胞2遍，1 000 r/min离心5 min。重置细胞于400 μL PBS中，上机进行流式细胞检测，使用Beckman Coulter软件采集数据。

RT-qPCR测定成骨基因mRNA的表达：将第3代骨髓间充质干细胞按每孔1×10⁶接种至6孔板内，待细胞融合度达70%时以MOI值为50进行慢病毒感染，实验分为3组：用携带低氧诱导因子1α的慢病毒感染骨髓间充质干细胞作为实验组、用不携带低氧诱导因子1α的慢病毒感染骨髓间充质干细胞作为空载体组、不进行处理的骨髓间充质干细胞作为空白对照组。在感染48 h后倒置荧光显微镜下观察实验组荧光分布情况，评估慢病毒对骨髓间充质干细胞的感染效率。分别于感染后1，4，7，14 d用Trizol法提取各组骨髓间充质干细胞的总RNA，反转录为cDNA，设计引物(表1)，用RT-qPCR法检测成骨基因骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶的表达水平。为消除样品量的差异，引入内参基因GAPDH进行校正。记录Ct值(基本循环数)，即每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经过的循环数。根据内参基因GAPDH的循环数计算出ΔCt(基本循环与内参循环数差值)，依据2^-^ΔΔCt相对定量法：ΔΔCt=(Ct_目的基因-Ct_管家基因)_实验组-(Ct_目的基因-Ct_管家基因)_对照组，计算出目的基因的相对拷贝数。

统计学分析：应用SPSS 13.0软件包作统计学处理，计量资料采用x(_)±s表示。采用ANOVA方差分析目的基因在不同时间点的表达水平有无显著性意义，当P < 0.05为差异有显著性意义。

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3.1 低氧诱导因子1α 低氧诱导因子1在缺氧诱导的各种相关基因的表达中起着关键的作用，包含有低氧诱导因子1α及低氧诱导因子1β两个亚基的异源二聚体。其中低氧诱导因子1β是结构亚基，起维持基因基本结构作用，低氧诱导因子1α是具有生物活性的亚基，有着调节低氧诱导因子1下游各基因表达的作用，并受到细胞内氧浓度的影响^[15]。低氧诱导因子1α的作用机制：①细胞处于常氧状态时：低氧诱导因子1α分子中402位和564位的脯氨酸残基在脯氨酰羟化酶的作用下被羟化后与肿瘤抑制基因VHL结合，经VHL识别后的部位发生泛素化反应，使得低氧诱导因子1α被导向蛋白酶体降解。②当细胞处于低氧状态时：脯氨酰羟化酶活性丧失，低氧诱导因子1α不能被羟化，无法被导向蛋白酶体降解，其表达量显著增加，在细胞内大量聚集^[16]。近年来有研究显示低氧诱导因子1α可以从以下两个方面诱导成骨：一方面直接诱导下游成骨因子的表达来促进成骨，如RunX2、IGF2、TGF-β、OC^[17-18]；另一方面通过诱导形成血管后间接刺激成骨因子的表达，低氧诱导因子1α诱导VEGF，NOS2，ET1等促血管生成因子的表达后^[19]，促进新生血管形成，局部营养环境得到改善，这样可间接促进成骨。 3.2 慢病毒载体转染系统把目的基因转移到靶细胞中的方法有很多，目前应用的基因载体分为两大类:非病毒载体和病毒载体^[20]。非病毒载体主要包括脂质体、聚合物等^[21]，这类载体的优点是可以大量生产，毒性反应及免疫抑制方面也相对较安全，但其转染效率低、表达量低、体内应用较困难。病毒载体主要有3种：反转录病毒、慢病毒和腺病毒^[22]。反转录病毒载体的缺点是负载容量小、整合的随机性有潜在的危险性、只能感染分裂期细胞，有临床试验结果表明，反转录病毒有诱发白血病的风险^[23]，其生物安全性受到广泛地质疑。腺病毒载体和慢病毒载体是现在使用最为广泛的两种方法。腺病毒载体可以感染分裂期及分裂期细胞，但是不能将目的基因整合到靶细胞的基因组中，因此不能持续稳定的表达外源基因。慢病毒载体是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)改造获得的，慢病毒载体系统包括表达载体及包装质粒，慢病毒表达载体即通常所说的穿梭载体，包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。在HIV的基础上删除了vif、vpr、vpu和nef 4个辅助基因，同时用表达水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的质粒和双嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的质粒，分别取代表达HIV本身包膜蛋白Env的质粒，使HIV-1载体颗粒包上了VSV或双嗜性MLV的包膜^[24]。包膜的更换进一步降低了慢病毒载体恢复成野生型病毒的可能，使HIV载体感染宿主的范围不再仅限于CD4⁺细胞，而扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞。VSV的包膜赋予慢病毒载体颗粒高度的稳定性，使其能够通过超速离心而浓缩，达到高滴度。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。具有以下优点：①可以感染分裂期细胞和非分裂期细胞。②能将目的基因整合至靶细胞基因组DNA中从而实现长期稳定表达。③可转移的基因片段容量大，最大可达到9 kb。④不易诱发宿主细胞免疫反应，不对宿主细胞造成损伤，其生物安全性得到保证^[25]。为了获得稳定的整合低氧诱导因子1α的种子细胞株，本实验选择慢病毒载体作为基因转染载体。

3.3 骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞是目前备受关注的一类具有多向分化潜能的组织干细胞，由于其多向分化潜能和强大的自我复制能力，在一定条件的诱导分化下能够向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等分化，可用于多种组织缺损的修复。由于骨髓间充质干细胞取材安全方便、来源丰富、体外培养方法简单、增殖迅速、免疫原性弱，还避免了伦理纷争，被公认为是理想的组织工程种子细胞来源。1987年，Friedenstien等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，而且这些细胞扩增20-30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞，其工作对今后骨髓间充质干细胞的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓间充质干细胞存在，而且创建了一种体外分离和培养骨髓间充质干细胞的简便可行的方法，这一发现使得用全骨髓贴壁培养法获得骨髓间充质干细胞得到了广泛的使用^[26]。全骨髓贴壁培养法是利用骨髓间充质干细胞贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性，用多次换液的方式将造血细胞清除，继续培养传至第3代后就可以得到高纯度的骨髓间充质干细胞。这一方法具有操作步骤简单，对细胞的损害小。对于采用全骨髓贴壁培养法分离筛选出的骨髓间充质干细胞需进行鉴定。目前对于骨髓间充质干细胞的鉴定都是通过细胞形态学观察及流式细胞仪的检测来进行的。骨髓间充质干细胞可以表达多种细胞表面标记物，主要有CD13、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166等多种表面抗原标记表达呈阳性(表达率>95%)^[27-28]。

3.4 成骨因子骨的形成是一个复杂的生理生化反应过程，需要多种因子参与。骨形态发生蛋白2是骨形态发生蛋白家族中的一员，骨形态发生蛋白在体内通过自分泌和旁分泌形式诱导骨的形成，其中骨形态发生蛋白2是促进骨形成和诱导成骨细胞分化最重要的细胞外信号分子之一，可以高效地诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化^[29]。在众多的诱导成骨基因之中，骨形态发生蛋白2是被研究最为深入的，已被批准用于治疗骨缺损及骨不连，美国FDA也于2002年7月批准重组骨形态发生蛋白2用于脊柱融合。碱性磷酸酶是骨形成过程中的重要功能性酶之一，是成骨细胞早期分化的标志。骨桥蛋白是在类骨质中有基质细胞产生的骨特异的、含唾液酸的蛋白质，在细胞和基质无机物之间起桥连作用。成骨细胞、骨细胞及破骨细胞均可以分泌骨桥蛋白，在骨基质的矿化和吸收过程中有重要作用。骨桥蛋白分子中有一富含天冬氨酸的区域，通过这一区域骨桥蛋白可以与组织中的羟基磷灰石结合而发生作用，从而促进骨基质的矿化。骨钙蛋白是由成骨合成和分泌的维生素K依赖性钙结合蛋白，是一种非胶原酸性糖蛋白。在正常生理情况下，骨钙蛋白特异的与羟磷灰石结合，调整骨矿化沉积速率，调节骨的生长，由于骨钙蛋白主要在矿化形成期出现而被认为是成骨细胞成熟向矿化发生期分化的标志之一。因此碱性磷酸酶、骨桥蛋白、骨钙蛋白被当作是成骨细胞成熟、分化及骨基质形成矿化的标志^[30]。

本实验成功从Hela细胞中扩增出低氧诱导因子1α基因片段^[31]，然后利用慢病毒载体将低氧诱导因子1α导入至大鼠骨髓间充质干细胞基因组DNA中，未见到明显的毒性反应，细胞生长良好。由于慢病毒载体自带增强型绿色荧光蛋白，荧光显微镜下观察见骨髓间充质干细胞能大量表达低氧诱导因子1α(荧光强)。通过全骨髓贴壁培养法分离培养出大鼠骨髓间充质干细胞，形态学观察到细胞的生长形态变化情况与文献相符，同时流式细胞仪检测了分离得到的骨髓间充质干细胞表面标记物CD90与CD105表达呈阳性(分别为99.8%、97.3%)，证明成功的获得大鼠骨髓间充质干细胞。使用荧光定量PCR法对携带低氧诱导因子1α的慢病毒感染过的骨髓间充质干细胞的cDNA进行检测分析发现实验组成骨因子骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、骨桥蛋白、碱性磷酸酶表达水平显著高于空载体组及空白对照组(P < 0.05)，表明在体外实验中低氧诱导因子1α可以提高骨髓间充质干细胞中成骨因子的表达水平，提高其成骨活性，为下一步低氧诱导因子1α在动物实验中促进骨缺损修复奠定理论基础。

携带低氧诱导因子1α慢病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞后成骨基因的表达

Expression of osteogenic genes in rat bone marrow mesenchymal stem cells infected by lentivirus carrying hypoxia-inducible factor-1 alpha

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